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Título: "Standardization of autoantibody testing:
a paradigm for serology in rheumatic diseases"

Autores: Pier Luigi Meroni, Martina Biggioggero, Silvia S. Pierangeli,
Joanna Sheldon, Ingrid Zegers and Maria Orietta Borghi.

Meroni, P. L. et al. Nat. Rev. Rheumatol. 10, 35–43 (2014);
published online 26 November 2013; doi:10.1038/nrrheum.2013.180

Clic aquí para acceder al artículo completo.

Introduction
Autoantibody testing in SARDs

Growing evidence indicates that early diagnosis followed by prompt and aggressive treatment increases the probability of inducing remission in the majority of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARDs). Furthermore, treating the disease in the early phases can reduce the risk of irreversible tissue damage and improve the overall prognosis.1 As the most frequent biomarkers of many SARDs, autoantibodies form part of the classification criteria for most of these conditions (Table 1). Quantification of variations in serum titres of some autoantibodies can also offer information on disease activity and/or the effect of immunosuppressive treatment; a key example is levels of anti-doublestranded DNA (dsDNA) antibodies, which are commonly used for monitoring disease activity in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). In addition to their defined role in the classification and diagnosis of SARDs, several autoantibodies can be used as biomarkers of the involvement of particular tissues or organs, making such assays important in defining relevant comorbidities and determining the risk of developing severe disease. Anti-citrullinated peptide antibodies (ACPA), for example, can be related to the prognosis of rheumatoid arthritis (RA), whereas anti-phospholipid antibodies (aPL) are associated with the presence of specific clinical manifestations of anti-phospholipid syndrome (APS).
Autoantibodies, therefore, are vital not only in evaluating the risk of developing specific complications of SARDs, but also in identifying subgroups of patients with different prognoses that require different clinical management strategies (Table 2). Autoantibody positivity may be the determining factor in starting primary prophylactic therapy, even in the absence of overt clinical signs, in order to reduce the risk to the patient. The analytical reproducibility and overall reliability of such measurements are, therefore, essential.


Experto invitado:
Dr. Carlos Perandones

La presente revisión, realizada por un distinguido grupo de referentes internacionales en el tema, remarca alguna de las múltiples dificultades presentes en las determinaciones del laboratorio serológico que son utilizados en la práctica médica.

Habla de la conocida variabilidad intra ensayo (misma muestra realizada por duplicado o más en el mismo ensayo), la inter ensayo (misma muestra realizada en diferentes ensayos), la inter laboratorio (misma muestra realizada en diferentes laboratorios), las heterogeneidad de las técnicas existentes para el mismo anticuerpo, que conducen a resultados dispares, y que a veces ni siquiera ponen de manifiesto el mismo sistema antígeno-anticuerpo.

Resaltan el hecho que esta variabilidad de resultados puede conducir a errores diagnósticos y a repetición de estudios con el consiguiente aumento de costos.

Así sugieren la necesidad de estandarizar los procedimientos pre analíticos (previos al ensayo), los analíticos (el ensayo) y post analíticos (posteriores al ensayo) para lograr una homogeneización de los resultados, si bien la revisión se centra solamente, en algunos elementos analíticos.

La importancia de estas estandarizaciones se ven reflejadas claramente en aquellos test cuantitativos donde los títulos (cantidad de anticuerpos) correlacionan con alguna variable clínica, como por ejemplo son los de anti ADN o anti proteinasa 3, y por ende la reproductibilidad analítica y la confiabilidad de la medición numérica es crucial.

Relata el desarrollo histórico de las determinaciones de laboratorio, desde aquellos métodos históricos, artesanales, manuales, cualitativos o semi cuantitativos que se realizaban solo en laboratorios especializados y en modelo actual de métodos cuantitativos, automatizados que se realizan en laboratorios no especializados. Sin embargo esta modernización puso de manifiesto la necesidad de contar con controles y aseguramiento de calidad, estandarizaciones, reportes de sensibilidad y especificidad analítica, sensibilidad clínica, demostración del valor o utilidad del test y desnudó la variabilidad inter ensayo e inter laboratorio.

Los actores de los test serológicos son el antígeno, el anticuerpo, a veces el anti anticuerpo, diferentes reactivos, el medio o fase donde se realiza, calibradores y el analizador (Microscopio, Lector de Densidad Óptica, etc.). El origen de todos estos elementos son variables críticas que pueden afectar los resultados.

Refiriéndose al antígeno, destaca el conocido valor de diferenciar anticuerpos anti ADN simple versus doble cadena, al igual que los anticuerpos anti citrulinados donde si bien la mayoría de los pacientes con AR tienen reactividad con varios antígenos citrulinados, un porcentaje de pacientes tienen reactividad restringida, por ende si esos antígenos no están presentes, el ensayo arrojara resultados negativos.

Ejemplifica la forma de fijar los antígenos a la fase (placa) y cita los ejemplos de proteinasa 3 y protrombina, que según como sea el antígeno unido a la placa, permitirá exponer o no sus determinantes antigénico (o epitopes) que son el sitio donde se debe unir el anticuerpo investigado.

Los antígenos que son generalmente proteicos, pueden exponerse en el sistema analítico básicamente con su estructura primaria (secuencia de aminoácidos) o cuaternaria (conformación espacial). Esto ha motivado a lo largo del tiempo discrepancias entre anticuerpos analizados de diferentes formas (doble difusión vs western blot). La revisión remarca 3 ejemplos, la protrombina, la β2 glicoproteína I y el Ro, donde las características químicas del antígeno presente, son esenciales para detectar su correspondiente anticuerpo.

Respecto a los anticuerpos necesarios para utilizar como referencia, destaca las fortalezas y debilidades de los anticuerpos policlonales y monoclonales. Los primeros, que son aquellos presentes en pacientes con enfermedades inflamatorias sistémicas, son un pool de anticuerpos generados naturalmente con diferentes afinidades por los antígenos, de uno o varios pacientes, pero que su disponibilidad va a ser limitada y por ende necesariamente reemplazable en el futuro. Los monoclonales desarrollados en animales, representan un tipo selecto de anticuerpos, con afinidad única generalmente contra epitopes lineales (estructura primaria), pero que tienen como fortaleza su producción casi ilimitada y estable en el tiempo. Si bien la generación de clones a partir de pacientes es posible, las experiencias en la actualidad no han arrojado aun resultados ideales.

Describe los 3 esfuerzos históricos más importantes para estandarizar métodos serológicos en enfermedades inflamatorias sistémicas. El encabezado por Dr. Eng M. Tan en la década del 80 (the Autoantibody Standardization Committee), el European Autoimmune Standardization Initiative iniciado en el 2002 y el Working Group on Harmonization of Autoantibody Tests (WG-HAT) del 2009, que si bien presentaron algunas diferencias, el objetivo primario fue semejante.

Posteriormente, narra los esfuerzos con resultados promisorios que condujeron a estandarizaciones en la determinación de anticuerpos anti fosfolipídicos y citrulinados, que han permitido algún grado de homogeneización en los resultados, utilizando diferentes kits comerciales.

Finalmente, describe la evolución tecnológica de los anticuerpos antinucleares desde los métodos antiguos como la difusión, aglutinación o fluorescencia a los modernos de fase sólida, determinaciones múltiples y automatizado conocido como multiplex, que aun teniendo mejor sensibilidad analítica, ha mostrado una débil o diferente asociación con enfermedad clínica respecto a los métodos antiguos. A modo de ejemplo describe que con estas técnicas modernas el 35% de pacientes con lupus eritematoso sistémico presentan anticuerpos antinucleares negativos.

Quiero por último, remarcar la importancia de estos esfuerzos, el poder contar con métodos estandarizados de laboratorio universalmente validados, nos va a permitir medir lo mismo a lo largo y ancho del planeta, semejante a lo que fue la estandarización de sistema métrico decimal. Pero debemos siempre recordar un dogma de los estudios complementarios, la sensibilidad, especificidad, valores predictivos son patrimonios de los test, por ende, si utilizamos test nuevos, enteramente nuevos o con algunos actores nuevos (antígenos, sustratos, métodos de evaluación, niveles de corte, etc.) estas características de los test deben ser redefinidos, al igual que sus asociaciones clínicas.


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